摘 要：目的：通過構建體內外骨質重塑模型，探討Notch信號通路與miRNA-155的相互作用，明確其在難治性鼻竇炎骨質重塑中的作用及機制。方法：選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質，檢測Notch的表達及與骨質重塑相關細胞因子的關系。檢查制備兔鼻竇炎模型，采用CT掃描及病理切片進行骨質重塑的評分。HE、堿性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色，從組織學水平對標本骨質的炎癥程度進行評估，探討不同時間兔鼻竇炎癥變化程度，通過CT值評估骨質重塑的程度。結果：Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮一定作用。結論：Notch信號傳導通路在鼻竇炎模型兔疾病的發(fā)生發(fā)展中，具有重要的調控作用。 關鍵詞：鼻竇炎模型兔 Notch 信號通路 慢性鼻竇炎(CRS)是發(fā)生于鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。歐洲的一項多中心研究顯示CRS的患病率為6.9%～27.1%，中國CRS的發(fā)病率為2.2%～8%，且常合并哮喘及慢性阻塞性肺疾病等下呼吸道疾病，已成為嚴重的公共健康問題[1]。Notch受體于1917年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，于1983年被首次克隆并命名[2]。Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮一定作用[3]。因此，本項目通過體外培養(yǎng)破骨細胞，并觀察與骨質重塑密切相關的多種蛋白和細胞因子與Notch信號通路的關系，用mi RNA-155阻斷細胞Notch信號通路的傳導，觀察蛋白及細胞因子表達的變化。 資料與方法 分離、培養(yǎng)兔大腿骨骨髓破骨細胞，比較細菌脂多糖(LPS)刺激前后不同時相Notch受體表達與多種蛋白和細胞因子的關系。(1)選用新西蘭白兔，斷頸處死，無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。接種于10 cm培養(yǎng)皿，標準培養(yǎng)(飽和濕度、5%CO2、37℃)12 h后收集非貼壁細胞，1 500 r/min,37℃離心5 min，棄上清，視為破骨前體細胞，加入M-CSF(20 ng/m L)和RANKL(30 ng/m L)誘導其向破骨細胞分化。HE、堿性磷酸酶和TRAP染色，光鏡下觀察破骨細胞形態(tài)。(2)利用RT-PCR、Westernblotting與流式細胞術在m RNA與蛋白水平檢測Notch受體在破骨細胞的表達。試驗組分別加入含不同濃度的LPS的培養(yǎng)液，對照組只加入含5%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液，形態(tài)學觀察及四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)細胞計數(shù)。觀察Notch蛋白表達量的變化。評估這些變化與破骨細胞數(shù)量變化的關系。(3)另選幾組在加入含LPS的培養(yǎng)液同時，用mi RNA-155阻斷細胞Notch信號通路的傳導，觀察蛋白及細胞因子表達變化和破骨細胞數(shù)量變化。 制備兔鼻竇炎模型，并評估骨質重塑的程度：(1)選擇新西蘭白兔進行CT檢查，并建立排除鼻和鼻竇疾病的模型。該細菌獲自國際標準金黃色葡萄球菌菌株，并用作1麥當勞單位(108CFU/m L)在正常生理鹽水中的懸浮液。稱重動物并通過耳靜脈注射用2.5%戊巴比妥鈉0.8 m L/kg麻醉。在鼻子后面的中線右側做一個1～1.5 cm的縱向切口，將皮下組織與骨膜分開。在上頜竇的前壁開一個直徑為3 mm的孔，取適量的無菌棉球并使用內鏡。在直視下，上頜竇并沒有完全被上頜竇的內側所阻塞。使用1 m L注射器，將0.3 m L細菌懸浮液吸入鼻竇和上頜竇的絨毛，然后逐層縫合骨膜，皮下組織和皮膚，并使用酒精，消毒傷口。(2)到達實驗周后，進行CT掃描以測量每個顯示上頜竇骨壁的CT圖像中最厚骨骼的CT值，并獲得最大值、最小值和平均值。收集CT數(shù)據(jù)后，筆者記錄了該動物死于5種過量的鈉過量。保留鼻頜竇組織的樣本。將樣品在10%中性甲醛中固定3 d，用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣2個月，包埋在常規(guī)石蠟中，制備連續(xù)切片并用HE染色。每只動物隨機選擇5片上頜竇和上頜竇壁，并在光學顯微鏡下觀察、評估上頜竇和上頜竇壁的骨質量。 選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質，檢測Notch受體的表達，及其與骨質重塑相關多種蛋白和細胞因子的關系。選取兔鼻竇炎模型鼻道竇口復合體骨質，利用RT-PCR、Westernblotting與流式細胞術檢測Notch受體的表達。觀察細胞因子與Notch蛋白的關系，以及與骨質重塑程度的關系。 mi RNA-155抑制Notch信號通路對兔鼻竇炎模型骨質重塑的影響。兔鼻竇炎模型腹腔注射mi R-155抑制Notch信號通路，采用CT掃描及病理切片進行骨質重塑的評分。HE、堿性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色，從CT值及組織學水平評估標本骨質炎癥程度的變化，選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質，檢測Notch受體的表達，進而探討mi RNA-155與Notch信號通路的交互作用。 結果 Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮著一定的作用。詳見圖1。 圖1 小鼠鼻中隔黏膜Notch1-4m RNA的表達量比較 討論 因為Notch受體及其配體包含跨膜區(qū)域，所以Notch信號傳導途徑在相鄰細胞之間傳遞信息。當配體與相鄰細胞中的受體結合時，只有金屬蛋白酶家族的腫瘤壞死因子轉換酶(TACE)被激活，Notch受體的大多數(shù)胞外域(NECD)被TACE阻斷，內部結構被阻止、觸發(fā)。結構域(NICD)中的構象變化使其更容易受到γ-分泌酶的作用，并且NICD在第二次切割后釋放。NICD以兩種方式轉運到細胞核，從而激活下游靶基因。即c-蛋白結合因子1(CBF1)依賴性途徑(也稱為經(jīng)典途徑)和CBF1非依賴性途徑(也稱為非經(jīng)典途徑)。CBF1在與NICD結合之前是一個轉錄阻遏物，可能會抑制Notch靶基因的轉錄。當NICD進入細胞核時，它與CBF1和轉錄激活蛋白家族MAML結合，將CBF1從轉錄阻遏物轉化為激活物，形成促進Notch靶基因轉錄的三元復合物。最著名的缺口靶基因是編碼基本螺旋-環(huán)-螺旋(b HLH)家族的轉錄因子的基因。這些轉錄因子可以進一步調節(jié)下游分子的表達。到目前為止，關于非經(jīng)典途徑的研究很少，并且尚不清楚細胞如何在這兩種途徑之間進行選擇。此外，研究表明，Notch信號通路本身具有負反饋調節(jié)機制。該機制對于維持Notch信號通路中適當?shù)幕钚运胶途S持細胞穩(wěn)態(tài)的調節(jié)至關重要。 研究表明，Notch信號通路在鼻竇炎的炎癥過程中起重要作用，不僅影響B(tài)和T淋巴細胞的發(fā)育和免疫反應，而且影響骨骼重塑的調節(jié)。Notch信號傳導可通過降低OPG表達水平以非細胞自主方式調節(jié)破骨細胞的形成。體外實驗還表明，Notch1和Notch2信號可以自主調節(jié)骨疾病細胞的分化過程。抑制骨病前體的Notch 1信號以促進分化為骨病細胞。用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號或用sh RNA干擾阻斷Notch 2信號可以阻斷由核因子-k B受體激活劑配體誘導的骨病性細胞分化過程。Notch 2信號的激活可能會促進NF-k B。受體活化劑配體誘導的骨分裂和分化過程。因此，在骨疾病的分化過程中，調節(jié)切口信號的過程涉及兩種細胞方法(自主或非自主)。由于骨病性前體細胞主要表達Notch 2受體，因此表明Notch信號傳導的聯(lián)合作用可能是骨病性細胞分化的積極調節(jié)劑。 參考文獻 [1]Heng Z,Min T,Pin-Fang K,et al.Effects of irbesartan on Notch1 signaling pathway in diabetic rats with myocardial injury[J].Chinese Journal of Applied Physiology,2018,34(5):427-431. [2]Hsiao CD.Overexpression of Notch Signaling Induces Hyperosteogeny in Zebrafish[J].International Journal of Molecular ences,2019,20(15):3613. [3]Wu TY,Hu HH,Chen C.Effects of ivabradine on Notch and NF-kappa B signaling pathway in myocardial cells of rats with myocardial infarction[J].海南醫(yī)科大學學報:英文版,2019,25(11):9-13. [4]蔡萬翔,江蓉星,王敏,等.活血通絡湯在家兔激素性股骨頭缺血性壞死模型中對Notch1、DLL3和HERP1的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018(1):300-303. [5]胡敏利,應雙偉,羅文達.mi R-92a-3p靶向調控NOTCH信號通路對T-ALL細胞增殖的影響機制[J/OL].重慶醫(yī)學:1-6[2020-12-28]. 本文由期刊論文網(wǎng)首發(fā)，一個權威專業(yè)的學術論文發(fā)表知識網(wǎng)。 文章名稱：鼻竇炎模型兔的Notch信號通路功能的動態(tài)變化