摘要： 膜蛋白具有廣泛的功能，參與細胞增殖分化、信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等多種細胞活動，是近年來生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點之一。年。膜蛋白天然構(gòu)象的穩(wěn)定性維持其生物活性 關(guān)鍵因素是新型納米材料納米盤技術(shù)利用兩親性膜支架蛋白穩(wěn)定水相中的磷脂分子，然后自組裝形成類似的盤狀結(jié)構(gòu)到天然磷脂雙分子膜環(huán)境，為膜蛋白的研究提供了理想的平臺。與傳統(tǒng)的假膜技術(shù)相比，納米盤具有溶解性強、穩(wěn)定性好、尺寸可控、生物相容性高、半衰期長等優(yōu)點。同時，它可以精確設(shè)計選擇性瞄準，具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。本文介紹了納米圓盤技術(shù)在膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用，并綜述了其在臨床醫(yī)學領(lǐng)域的新研究進展，包括納米圓盤作為疏水性藥物的轉(zhuǎn)運載體和抗腫瘤靶向治療，載藥率高，藥物控釋，靶向功能承載能力強；作為小分子蛋白膜狀環(huán)境對靶蛋白的固定作用，作為高密度脂蛋白的有效補充劑，在心血管疾病中去除膽固醇的高效性和有效性可控性。綜上所述，納米盤技術(shù)可以為未來膜蛋白相關(guān)研究和其他臨床疾病的診治提供新的方法和新的思路。 關(guān)鍵詞：　納米盤; 膜蛋白; 靶向治療; 疫苗制備; 心血管疾病; 　　Abstract：　A major challenge in the research on membrane protein is to deal with the absence of the lipid bilayer environment, which requires a mimic “native-like” lipid bilayer. Nanodisc, using amphiphilic membrane scaffold proteins (MSPs) to stabilize phospholipid molecules in the aqueous phase, self-assembly forms a disc-like structure similar to the natural phospholipid bilayer membrane environment. As a cutting-edge technique, nanodiscs are reported to provide model membrane environment of water solubility, homogeneity, control of oligomerization state and size, composition and specific functional modification on nanometer scale as well. In this review, we introduced the reconstitution of MSPs and integral proteins to introduce nanodiscs, followed by the nanodiscs applications in structural, functional and medical fields of membrane proteins. As for its medical applications, the high efficiency of delivery capacity as a carrier of hydrophobic drugs, and the targeting specificity of antineoplastic were particularly highlighted. Nanodisc technique also help to throw a light on the structural resolution and functional characterization of membrane proteins in imaging technology. Moreover, nanodiscs are applied to cardiovascular disease to boost the efficiency and manoeuvrability of cholesterol transport. In summary, nanodisc technique provides new method and insight into membrane protein research in the future, for better diagnosis and treatment of clinical diseases. 　　Keyword：　nanodiscs; membrane protein; targeted therapy; vaccine preparation; cardiovascular diseases; 　　膜蛋白是指能夠結(jié)合或整合到細胞膜或細胞器膜上的蛋白質(zhì)總稱，其在細胞中含量豐富，是生物膜功能的主要執(zhí)行者，在細胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號轉(zhuǎn)導及物質(zhì)運輸?shù)确矫婢哂兄匾δ?不同于水溶性蛋白，膜蛋白體外很難獲得穩(wěn)定、均勻且正確維持膜蛋白生物構(gòu)象的擬膜環(huán)境，這極大地限制了天然膜蛋白的研究[1]，而納米盤技術(shù)則有望成為解決這些問題的有力工具[2].納米盤采用兩親性的膜支架蛋白（Membrane Scaffold Proteins, MSP）在水相中穩(wěn)定磷脂分子從而形成盤狀結(jié)構(gòu)，這類似于天然磷脂雙分子層膜環(huán)境，同時通過整合進入其中的膜蛋白,可以在近似天然膜環(huán)境狀態(tài)下保持膜蛋白生物活性.該體系還具有良好的生物相容性及較長半衰期、可精準設(shè)計選擇性靶向等優(yōu)點[3]，從而為膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究提供了良好平臺. 　　納米盤技術(shù)在膜蛋白純化領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，如：研究者將細胞色素P450（CYP450）在昆蟲細胞中過量表達，再將其溶解在高濃度的膽酸鈉溶液后,加入MSP顆粒，通過去污劑膠束化去除膽酸鈉，得到含CYP450的納米盤，進一步通過鎳離子親和層析和分子篩等技術(shù)進行純化,最終得到純度高、構(gòu)象天然、功能完整的目標膜蛋白[4,5].納米盤在此純化過程中，既能夠保證目標膜蛋白始終處于脂質(zhì)雙分子層中，又能最大限度避免其天然活性結(jié)構(gòu)與功能遭到去污劑接觸的破壞.此外，還有多個課題組通過類似研究方法純化得到了多種功能膜蛋白，如CYP3A4蛋白[6]、CYP73A5蛋白[7]、用于結(jié)構(gòu)蛋白研究的細胞色素b5[8]、人體重要鐵還原酶101F6 [8,9]等，這些膜蛋白經(jīng)多種實驗方法驗證，納米盤技術(shù)可保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，實驗過程可靠且可復制. 臨床醫(yī)學研究中納米盤技術(shù)的巨大潛力 　　納米盤也可以在簡單的無細胞反應(yīng)中迅速組裝為均質(zhì)實體，在這一過程中，無需時刻關(guān)心溶液中脂質(zhì)體與蛋白質(zhì)的比例，也無需通過大量實驗找尋一種合適的去污劑來增溶、穩(wěn)定膜蛋白后再進行純化.例如從哺乳動物細胞上提純ERBB蛋白時，納米盤技術(shù)能夠解決在傳統(tǒng)去污劑環(huán)境下過度依賴融合標簽、去污劑增溶等問題[10,11]，納米盤在此過程中發(fā)揮著其均質(zhì)性、對低聚狀態(tài)的控制優(yōu)勢，而這種無細胞系統(tǒng)降低了相關(guān)污染物出現(xiàn)的可能性，進一步確保了目標膜蛋白純度[12]. 　　作為一種新型納米生物材料，納米盤的應(yīng)用范圍因其自身性能特點不斷拓展[13]，已經(jīng)從最初的膜蛋白純化以及膜蛋白結(jié)構(gòu)研究拓展到受體配體相互作用研究，同時在生物醫(yī)學臨床研究領(lǐng)域也表現(xiàn)出巨大的潛力.納米盤作為藥物載體，可有效溶解水溶性差的藥物，并且能夠裝載一些低生物利用度藥物，有力推動藥物診斷與治療學研究的迅猛發(fā)展.此外，納米盤在心血管疾病治療、聯(lián)合化療免疫療法的腫瘤治療、疫苗制備等方面亦做出重要貢獻.本文將基于近年納米盤技術(shù)研究現(xiàn)狀，對其在膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究及臨床醫(yī)學中的應(yīng)用進行重點梳理與綜述. 　　1 、納米盤——一種新型擬膜技術(shù) 　　納米盤是一種由磷脂和MSP顆粒自組裝而成的盤狀磷脂雙分子層，其中的MSP顆粒是一種類似ApoA-1蛋白的人工膜支架蛋白. ApoA-1是人體中高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein, HDL）的重要組成部分，在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運（Reverse Chlesterol Transport, RCT）過程中發(fā)揮著重要作用. ApoA-1由243個氨基酸殘基組成，將其N端的43個氨基酸殘基切掉后可形成一種柔軟而具有韌性的MSP顆粒，能夠用來制備納米盤[14].制備納米盤最常見的方式是通過適當摩爾比，將MSP顆粒添加至去污劑穩(wěn)定的磷脂當中，然后選擇合適的方法去除去污劑，最終MSP顆粒會禁錮脂質(zhì)體而形成一個盤狀復合體，即納米盤.其中，應(yīng)用最多的兩種MSP顆粒分別是MSP1D1和MSP1EE3D1.通過這種方法制備的納米盤能夠在純化膜蛋白時最大限度地保持其天然構(gòu)象，以便于進一步研究[15]. 　　當納米盤技術(shù)與膜蛋白的純化過程結(jié)合時，主要有兩種方式（如圖一）.其一，首先利用去污劑或其他傳統(tǒng)手段將膜蛋白提純，得到純凈單一的目標膜蛋白，然后將目標蛋白與MSP顆粒以適量的摩爾比混合，加入脂質(zhì)，讓目標膜蛋白自聚，從而實現(xiàn)膜蛋白在納米盤這種擬膜環(huán)境上表達；其二，直接將MSP顆粒引入膜蛋白混合物中，同時加入過量脂質(zhì)，取得多種納米盤結(jié)構(gòu)，其中有表達目標膜蛋白的，也有干擾目標膜蛋白表達的，最后將不同納米盤分類純化，從而實現(xiàn)僅留下目標膜蛋白表達納米盤的純化目的[16]. 　　圖一 利用納米盤純化膜蛋白的兩種途徑 圖一 利用納米盤純化膜蛋白的兩種途徑 　　Fig. 1 Two different purification methods of target membrane protein by nanodiscs 　　利用納米盤純化膜蛋白，首先將細胞膜上膜蛋白溶解得到膜蛋白混合物，后可選用：（方法一）1純化膜蛋白混合物，得到目標膜蛋白純凈物后，將目標膜蛋白整合嵌入納米盤中，得到含目標膜蛋白的納米盤；或（方法二）2先將磷脂分子和MSP顆粒加入膜蛋白混合物中，使多種膜蛋白自組裝成納米盤混合物，而后將此含有多種膜蛋白的納米盤進行純化而得到含有目標膜蛋白的納米盤. 　　純化過程中納米盤的大小還可以通過改變MSP顆粒的序列進行精準控制，Denisov等人[17]嘗試用長短不一的MSP顆粒進行納米盤的組裝，并通過小角X射線散射（Small Angle X-ray Scattering）數(shù)據(jù)擬合到圓柱模型來測量納米盤的尺寸，研究發(fā)現(xiàn)，從MSP1序列（直徑為9.8 nm的納米盤）開始，作者分別插入一個（MSP1E1）、兩個（E2）、三個（E3）22-mer的MSP顆粒，可以得到直徑分別為10.6 nm、11.9 nm和12.9 nm的納米盤. 　　綜上，納米盤利用其自身的均一性和低聚性，通過人工MSP顆粒與目標膜蛋白融合而發(fā)生自聚從而實現(xiàn)目標膜蛋白的純化.這一方法可以通過溶液中過量的脂質(zhì)和蛋白實現(xiàn)，能夠大大減少膜蛋白純化的步驟，降低其純化難度，在未來膜蛋白的研究中大有可期；同時由于其雙分子層呈現(xiàn)出的天然性，其制備的膜蛋白在結(jié)構(gòu)上更加完整、不易受到去污劑的影響和破壞，膜蛋白的功能也更加接近天然構(gòu)象下的狀態(tài). 　　2、 納米盤技術(shù)——膜蛋白功能研究的理想平臺 　　膜蛋白不僅可作為細胞膜的支架結(jié)構(gòu)，也在信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)運輸?shù)燃毎M程中起到關(guān)鍵作用[18,19].但由于其自身具有雙親性質(zhì)，難以直接純化，在過度表達的過程中容易產(chǎn)生細胞內(nèi)毒性、蛋白錯誤折疊、膜表面蛋白聚集等問題，這些都極大地限制了天然膜蛋白的研究[1]，而納米盤技術(shù)則有望成為解決這些問題的有力工具之一. 　　七跨膜螺旋G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）家族廣泛介導細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導[20]，參與嗅覺、味覺[21]和光線的感知，一直是功能膜蛋白研究熱點. Leitz[22]等人利用十二烷基j3-D-麥芽糖苷將在HEK293細胞中表達的GPCRs家族蛋白j3?AR溶解，并混合添加MSP1和膽酸鹽溶解的POPC，隨后去除去污劑得到j(luò)3?AR納米盤和過量的納米盤，然后通過j3?AR蛋白C端的親和標簽將含有j3?AR的納米盤從游離納米盤中分離，得到高純度目標蛋白j3?AR.通過該方法得到的j3?AR保留了其結(jié)合激動劑和拮抗劑的能力，激動劑結(jié)合j3?AR單體時引入了鳥嘌呤的快速交換，與缺少G蛋白耦連時相比，G蛋白直接誘導單體與高親和力配體結(jié)合，證明在激動劑結(jié)合后觀察到的協(xié)同作用是G蛋白與受體單體的結(jié)合而非受體自身的寡聚[23]. 　　霍亂毒素（Cholera Toxin）通過與體內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合介導A-亞基向細胞質(zhì)的運輸，干擾G蛋白信號傳導并導致離子通道開放從而導致人體失水，同時有研究表明GM1頭部可以誘導其發(fā)生寡聚，從而影響其與霍亂毒素的親和力活性[24]. Borch等人通過調(diào)節(jié)每個納米盤上結(jié)合的神經(jīng)節(jié)苷脂的數(shù)量來限制其低聚，并經(jīng)表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance）分析發(fā)現(xiàn)每個納米盤中神經(jīng)節(jié)苷脂的數(shù)量與最大霍亂毒素B亞單位的直接結(jié)合存在線性關(guān)系.這驗證了神經(jīng)節(jié)苷脂即使在低摻入率下也可以在較長的距離中自由擴散并自聚.但研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)合過程的動力學和親和力參數(shù)會隨著納米盤中插入的神經(jīng)節(jié)苷脂數(shù)量變化而變化，尤其是當神經(jīng)節(jié)苷脂數(shù)量增加時，解離率有所降低，研究推測此結(jié)果與霍亂毒素B亞基的多價結(jié)合有關(guān)[25].隨著CYPs蛋白利用納米盤表達純化技術(shù)的日漸成熟，其與不同配體結(jié)合過程中的協(xié)同結(jié)合特性、功能特性以及膜效應(yīng)所產(chǎn)生影響的相關(guān)研究也得以開展.研究顯示，睪酮分子與嵌入在納米盤中的受體CYP3A4結(jié)合后，能夠顯著提高同類配體在另一個結(jié)合點上的親和性，與傳統(tǒng)模擬膜技術(shù)結(jié)果相比，受體嵌入納米盤后與配體睪酮結(jié)合具有更強的同質(zhì)協(xié)同結(jié)合性.為了進一步探究這一特性，實驗將CYP3A4與它的電子供體（Cytochrome P450 Reductase, CPR）一起整合到納米盤中，用以提供固定大小的催化活性單位，同時采用平衡底物滴定法和進行NADPH消耗的穩(wěn)態(tài)動力學測量兩種方法進行實驗，結(jié)果顯示嵌入納米盤的CYP3A4與單個睪酮分子及不同數(shù)目的睪酮分子復合物結(jié)合后具有顯著功能差異[26].在探究納米盤膜效應(yīng)對配體與受體結(jié)合過程影響的研究中，結(jié)果表明嵌入納米盤中的CYP3A4和溶液中未結(jié)合的CYP3A4相比，其與各種配體親和度的測量值均有顯著升高[4]. 　　膜蛋白納米盤在不同環(huán)境下表現(xiàn)不同功能的特性在一項關(guān)于血凝塊活化的臨床研究中得到了很好的應(yīng)用[27].正常止血過程以及許多危及生命的血栓性疾病中，凝血機制都是由血漿絲氨酸蛋白酶與組織因子整合膜蛋白[28]結(jié)合生成復合物后引發(fā)，該復合物活性受其所在膜環(huán)境的強烈影響.實驗中將該復合物整合進入不同脂質(zhì)構(gòu)成的納米盤后觀察其在不同環(huán)境下的蛋白水解活性，結(jié)果顯示在高濃度的陰離子磷脂中該復合物的活性最高，這項研究對臨床利用該復合物進行凝血治療有重要指導意義. 　　然而值得注意的是，當某些膜蛋白需要在膜兩側(cè)不同環(huán)境中進行功能重組時，使用納米盤模擬這種膜內(nèi)外的環(huán)境差異仍是難以實現(xiàn)的，這時納米盤則不再適宜作為擬膜環(huán)境對該目標膜蛋白及其配體結(jié)合過程進行研究.此外，納米盤大多采用ApoA-1衍生直徑為10-15 nm的MSP顆粒，而這一范圍也限制了對跨膜片段較少的膜蛋白受體及其配體結(jié)合過程的探究[29]. 　　3 、納米盤技術(shù)在臨床醫(yī)學研究中的巨大潛力 　　3.1、 藥物載體 　　藥物遞送系統(tǒng)是采用多學科手段將藥物有效地遞送到目標部位，通過調(diào)節(jié)藥物的代謝動力學、藥效、毒性、免疫原性和生物識別等特性，使藥物的治療效應(yīng)最大化的手段之一.目前臨床上已經(jīng)投入使用的藥物遞送系統(tǒng)有長效緩釋微球、口服緩控釋制劑和干粉吸入制劑等，其中最有應(yīng)用前景之一的則是基于納米盤作為藥物載體的遞送系統(tǒng). Counsell等人早在1982年就提出脂蛋白有作為藥物傳遞工具的潛能，但礙于當時的技術(shù)發(fā)展水平，這一研究沒有繼續(xù)[30,31].直到1993年Schouten等人開拓了HDL作為藥物載體的新領(lǐng)域[32]，而現(xiàn)今隨著納米盤技術(shù)研究的深入，更是推動了這一領(lǐng)域的新進展. 　　3.1.1、 疏水性藥物載體 　　據(jù)統(tǒng)計，目前新發(fā)現(xiàn)的藥物中約40％的化學藥物都是脂溶性藥物，由于其較低的水溶性大大限制了其在生物學方面的研究進展.在實際應(yīng)用中，尤其是靜脈注射給藥過程中常需要加入增溶劑提高其利用率，然而這種處理方式很容易導致注射劑量大以及產(chǎn)生毒副作用的問題，比如注射用紫杉醇在靜脈注射體內(nèi)后由于聚氧乙烯蓖麻油的使用易產(chǎn)生過敏性休克等副反應(yīng).因此尋求一種安全有效的疏水藥物載體以提高脂溶性藥物的利用率是亟待解決的問題. 　　納米盤由于其模擬生物膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，磷脂分子的親水頭部暴露在外側(cè)，親脂長鏈位于納米盤結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，裝載的藥物被包裹在內(nèi)部親脂長鏈中間，目前有大量實驗證明納米盤材料對親脂性的藥物具有較好的負載能力.研究表明，將廣為使用的疏水性化療藥物阿霉素（Doxorubicin）加入納米盤中進行給藥可引發(fā)癌細胞的免疫原性，誘導癌細胞死亡以發(fā)揮其抗腫瘤作用[33]，且過程中無明顯的脫靶副作用，這種給藥方式增強了CT26模型小鼠的免疫檢查點阻斷.此外，攜帶阿霉素的納米盤進入體內(nèi)可引起強大的抗腫瘤CD8+T細胞反應(yīng)，同時擴大對腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤新生抗原和完整腫瘤細胞的表位識別[34].據(jù)報道，含脂溶性藥物姜黃素的納米盤可成功應(yīng)用于肝細胞瘤、套細胞淋巴瘤以及多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞系的靶向治療研究中；含膽固醇琥珀酸單酯（Cholesteryl Hydrogen Succinate）修飾的紫杉醇納米盤能夠有效阻止該藥物在腫瘤模型小鼠體內(nèi)過早釋放，從而有望提高其抗腫瘤功效[35]；含ApoE3的納米盤能有效減少SAMP8模型小鼠體內(nèi)β淀粉樣蛋白的沉積，減少小膠質(zhì)細胞的增生，改善其神經(jīng)功能變化，從而挽救SAMP8模型小鼠的記憶缺陷[36]. 　　納米盤作為藥物載體除可以有效溶解一些水溶性差的藥物之外，研究還發(fā)現(xiàn)其裝載的藥物有較高的利用率及安全性，如抗真菌化合物兩性霉素B.采用納米盤載體結(jié)合該藥物后發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強大的抗真菌活性，且在治療劑量下未觀察到毒性，為抗真菌治療研究做出貢獻.此外，隨著納米盤在藥物載體方面的應(yīng)用不斷拓展，目前已廣泛用于裝載低生物利用度藥物，以治療腫瘤[37]、阿爾茨海默癥[38]等疾病，均在動物實驗階段有良好的結(jié)果反饋. 　　3.1.2 、腫瘤靶向藥物載體 　　目前在腫瘤疾病治療過程中化學療法的應(yīng)用已取得了巨大進展，但由于某些腫瘤易產(chǎn)生非特異性毒性，其療效仍未達到最理想效果.最近有研究提出，以癌細胞中過度表達的膜受體為靶點，設(shè)計靶向給藥系統(tǒng)，利用納米顆粒進行藥物載體化治療，是保證選擇性有效載荷傳遞，從而提高治療效果的有效方法[39]，這一思路為解決化學療法過程中基本的臨床問題提供了可能性. 　　作為研究熱點之一的納米遞藥系統(tǒng)構(gòu)建的藥物制劑尺寸小，粒徑分布窄，表面修飾后可以進行靶向特異性定位，達到藥物靶向輸送的目的，并且還能保護藥物分子，提高穩(wěn)定性與生物相容性，可將顯像和治療相結(jié)合，實現(xiàn)疾病的診斷和治療.基于這些優(yōu)點，越來越多的研究者開始關(guān)注利用納米載體用于藥物輸送的研究，以克服腫瘤治療中的困難. 　　最近的研究表明，Padma Kadiyala等人[40]通過在32-34只小鼠紋狀體內(nèi)植入GL26-cit腫瘤，構(gòu)建GL26同基因小鼠膠質(zhì)瘤模型，以模擬人類多形性成膠質(zhì)細胞瘤中的組織病理學特征.植入后第7天在腫瘤內(nèi)注射經(jīng)DiD熒光示蹤劑標記后的載藥納米盤，注射后24小時進行灌流，并對大腦進行共焦成像處理，實驗結(jié)果分析表明熒光示蹤劑信號與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān).為了進一步評估載藥納米盤在體內(nèi)的生物分布，研究者將GL26-wt細胞植入C57BL6小鼠模型一側(cè)大腦半球的紋狀體內(nèi)，注射后21天時對荷瘤和非腫瘤小鼠模型再注射經(jīng)DiR熒光示蹤劑標記后的載藥納米盤，于注射后24小時灌流小鼠，利用體內(nèi)光學成像系統(tǒng)（In Vivo Optical Imaging）觀察心臟、胸腺、肺、脾、肝、腦、腎等器官的熒光強度，結(jié)果顯示DiR熒光示蹤劑信號具有很強的腫瘤特異性，荷瘤動物的腫瘤側(cè)大腦半球可觀察到較強的熒光示蹤劑信號，在荷瘤動物的腫瘤對側(cè)半球或非腫瘤小鼠大腦中都沒有觀察到熒光信號，且肝臟、胸腺、心臟、肺、腎臟和脾臟中的熒光信號均不明顯，這表明通過納米盤作為載體的運輸途徑在治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤時可以到達并留在大腦內(nèi)的靶組織中，而不會在非靶器官系統(tǒng)中積聚，從而可以提高其體內(nèi)靶向效率，顯示了納米盤作為多形性成膠質(zhì)細胞瘤治療運載平臺的應(yīng)用潛力. 　　除此以外，納米盤給藥技術(shù)在疫苗制備過程中也表現(xiàn)出其良好的靶向應(yīng)用潛力.腫瘤疫苗是通過利用腫瘤細胞相關(guān)抗原，配合其他免疫刺激因子誘導機體激活特異性細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā).長期以來，腫瘤抗原遞呈的靶向性、有效性及安全性一直是腫瘤疫苗發(fā)展的重難點問題. Fang RH等[41]將寡聚核酸佐劑分子嵌入納米盤以模擬小鼠黑色素瘤細胞膜表面，攜帶腫瘤細胞特異性抗原的納米盤表面相對完整地保留了腫瘤細胞表面的組成成分和理化性質(zhì)，可以有效誘導抗原提呈細胞的成熟，刺激T細胞的增殖和免疫應(yīng)答，并可靶向進入淋巴結(jié)，增加納米疫苗的血液循環(huán)時間，進而克服了腫瘤抗原表達多樣化、抗原突變率高的問題. 　　迄今為止，納米盤作為藥物載體因其特殊的優(yōu)越性，如藥物控釋、靶向功能、高載藥率等，在應(yīng)用研究方面已經(jīng)取得了長足進展，但目前僅限在動物模型中進行相關(guān)測試，仍需進一步深入探究與驗證才有望在臨床使用當中更好發(fā)揮其作為藥物載體的優(yōu)勢. 　　3.2 、成像技術(shù) 　　在臨床研究中，疾病診斷和對藥物作用的觀察是必不可少的，而先進的成像技術(shù)能夠使這一過程更加精確.然而，在現(xiàn)有的小分子成像技術(shù)中，常常存在因目標蛋白異常聚集、渾濁樣品結(jié)晶困難而導致的觀察桎梏.將納米盤引入后，有助于實現(xiàn)親和標簽的固定，使目標膜蛋白即使面臨高濃度聚集情況時，也能在擬膜環(huán)境中保持其天然構(gòu)象、完整功能以及充分的流動性等特征. 　　X射線晶體衍射法（X-ray Diffraction）能夠以原子或接近原子水平的分辨率顯示生物分子的三維結(jié)構(gòu).在以往的研究中主要面臨結(jié)晶困難的問題.將納米盤引入后，觀察者們可以通過設(shè)計MSP顆粒使其形成一個二維的結(jié)晶格[42]，或使用特定的抗體為脂質(zhì)雙分子層提供更大的空間位置以便形成晶體的接觸，避免結(jié)晶困難等問題. 2020年，Jost[43]等人通過使用時間解析的小角度X射線散射法，研究了在分離的核苷酸結(jié)合區(qū)（Nucleotide-Binding Domains, NBDs）和脂質(zhì)納米盤中全長離子通道蛋白MsbA的背景下NBDs二聚化（ATP綁定時）的動力學和伴隨的結(jié)構(gòu)變化（ATP水解時），且研究數(shù)據(jù)能夠確定NBDs二聚化形成和分離的時間常數(shù). 　　冷凍電鏡（Cryo-Electron Microscopy）通過對樣品顆粒從不同角度拍攝最后進行疊加而得出分子結(jié)構(gòu)影像，這種方法對蛋白樣品的均一性有較高要求，此外蛋白樣品中一些結(jié)構(gòu)可變的柔性結(jié)構(gòu)也會對結(jié)構(gòu)測定造成較大影響.納米盤均一性高的優(yōu)勢可用來分離膜蛋白以及膜蛋白復合物，同時能夠避免其異常聚集且使其保持天然構(gòu)象和功能，為目標膜蛋白的冷凍觀測提供良好條件. Lee等人將納米盤與人類病原體Coxsackie病毒B3（CVB3）結(jié)合時發(fā)現(xiàn)在雙分子層表面附近的電子密度擴展現(xiàn)象和病毒外殼表面通道形成，取得了利用冷凍電鏡方法捕獲病毒侵入細胞研究的新突破[44]. 　　核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）技術(shù)同樣應(yīng)用于高分辨率的結(jié)構(gòu)生物學研究中[45]，但由于膜蛋白趨向于在膜表面發(fā)生聚集，導致了這一技術(shù)陷入研究瓶頸. 2016年，Yao等研究了BCL-2家族中一種重要抗癌藥物靶點BCL-XL在單獨分離和與納米盤結(jié)合的全長狀態(tài)下C端的不同，并發(fā)現(xiàn)BCL-XL在C端形成了跨膜α螺旋，但其本身具有流動性大、易受可溶性蛋白水解的特點[46]，這開拓了在后續(xù)抗癌藥物研發(fā)中藥物靶點的研究方向. 　　此外，由于納米盤的單分散度高、分散性好，在缺少膜蛋白完整的結(jié)構(gòu)測定時，納米盤也可以用于明確該種膜蛋白在擬膜環(huán)境下的長度和方向，還可以用來定義膜蛋白在天然雙層環(huán)境中的特定距離和方向[47].相關(guān)研究包括配體與麥芽糖轉(zhuǎn)運蛋白MalFGK2結(jié)合引起的構(gòu)象和動力學變化[48]，以及使用DEER光譜來檢測納米盤內(nèi)GPCRs結(jié)合信號配體后的構(gòu)象變化[49]，為研究藥物與體內(nèi)靶點結(jié)合提供了新的結(jié)構(gòu)學、動力學依據(jù). 　　除此之外，氧結(jié)合和自動氧化動力學在測量嵌入納米盤中的膜蛋白單體過程中顯示純粹的指數(shù)圖像，這與傳統(tǒng)的溶液聚集體不同，能夠有效避免在解釋實驗數(shù)據(jù)時產(chǎn)生的歧義，研究通過這種方法解釋了CYP450人體代謝酶CYP3A4單體的功能性意義，并對膜環(huán)境對配體結(jié)合的局部影響進行了精準而嚴格的評估[50].使用放射性標記的納米盤可以用來研究乳腺癌模型中相關(guān)巨噬細胞的定量正電子發(fā)射斷層掃描成像技術(shù)（Positron Emission Tomography），則顯示了納米盤在無創(chuàng)成像領(lǐng)域中的巨大優(yōu)勢與潛力. 　　除簡單的蛋白質(zhì)分子與藥物研究外，納米盤還可以作為造影劑載體應(yīng)用于臨床診斷.心血管疾病在早期發(fā)現(xiàn)后需要及時識別動脈粥樣硬化病變類型以區(qū)分穩(wěn)定性斑塊和不穩(wěn)定性斑塊，方便相應(yīng)治療.納米盤顆粒因其體積小可以穿透斑塊，并且已被證明可以在動脈粥樣硬化中靶向進入載脂巨噬細胞，而巨噬細胞浸潤程度與病變進展、斑塊大小和內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)，這為病變類型的診斷提供巨大的優(yōu)勢. Shaish等人首次在Apo E- /-小鼠的主動脈弓粥樣硬化病變中發(fā)現(xiàn)放射性標記的納米盤成分，這一發(fā)現(xiàn)吸引了研究者的興趣，Cormode和他的同事們繼續(xù)采用HDL進行NMR增強掃描.在利用NMR的實驗中，釓（Gd-）作為基礎(chǔ)的造影劑被納入到納米盤中，納米盤由富含載脂螯合物的單一脂質(zhì)成分重組而成.結(jié)果顯示核磁共振成像和光學成像的雙探針標記納米盤可以在體內(nèi)和體外進行多模態(tài)成像[51].例如，在注射后24小時，納米盤顆粒在Apo E- /-小鼠主動脈斑塊的巨噬細胞富集部位積聚，表現(xiàn)出了顯著增強的NMR信號.鑒于以上實驗研究，未來將成像和治療藥物集成在一個納米盤內(nèi)應(yīng)用于心血管及其他臨床疾病研究中，能夠?qū)崿F(xiàn)早期檢測、成像診斷及同時運載治療藥物這一目標[52]. 　　3.3 、心血管疾病中應(yīng)用 　　據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計報告顯示，心血管疾病目前已經(jīng)成為全球的頭號死因，占全球死亡總數(shù)的30%以上，是社會健康與經(jīng)濟的重要負擔之一.而動脈粥樣硬化是心血管疾病中冠心病（Coronary Heart Disease, CHD）發(fā)病和死亡的主要原因，因此全面防控患病危險因素，控制膽固醇水平成為降低冠心病死亡率的關(guān)鍵. 　　脂蛋白是血液中脂肪或膽固醇等脂溶性化合物的內(nèi)源性載體，具有明確的結(jié)構(gòu)和多種生物功能，在脂質(zhì)代謝中起主導作用，因而在動脈粥樣硬化病變的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)中也有巨大的研究意義. HDL顆粒是最小的一組脂蛋白顆粒，主要具有抗動脈粥樣硬化的保護作用，其潛在的保護機制依賴于HDL可以在ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1）與ABCG1（ATP-binding cassette transporter G1）依賴機制下從外周組織中去除多余膽固醇[53].具體過程以充滿脂質(zhì)的巨噬細胞為例，ApoA-1在肝臟和腸內(nèi)以無脂形式合成，通過肝細胞ABCA1轉(zhuǎn)運蛋白與磷脂和膽固醇迅速脂化，形成新生盤狀HDL.在外周組織中，新生的HDL顆粒通過巨噬細胞ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運蛋白吸收游離膽固醇，經(jīng)卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（Lecithin Cholesterol Acetyltransferase, LCAT）酯化形成球形HDL3.成熟的HDL3粒子形成，可以轉(zhuǎn)化為HDL2被肝臟吸收，也可能被內(nèi)皮或肝脂肪酶修飾[52]（如圖二），上述生理過程明確后經(jīng)進一步的脂質(zhì)組學和蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，血液高密度脂蛋白水平與心血管疾病發(fā)生的風險呈負相關(guān)，這使得人們普遍接受高密度脂蛋白血清濃度有助于預(yù)防心血管疾病的理論.與這些發(fā)現(xiàn)相一致，許多提高循環(huán)HDL水平的治療方法一直是藥學研究的焦點.然而，很快研究者們發(fā)現(xiàn)僅僅增加循環(huán)中的HDL顆粒數(shù)量遠遠不足以顯著治療心血管疾病，還應(yīng)注重提高加入循環(huán)中HDL的功能性，如HDL顆粒的大小和形態(tài)變化能力.納米盤組成和物理化學參數(shù)可以很容易地進行化學調(diào)節(jié)和操縱，通過反復實驗調(diào)整其尺寸、均勻性，使得清除膽固醇效率達到最佳狀態(tài)，從而能夠有效減少動物模型中動脈粥樣硬化改變，并已在治療心血管疾病的一些早期動物實驗中得到驗證[54].例如，在兔血管炎癥模型中，每日向血管中輸注嵌入二棕櫚?；?磷脂酰膽堿（Dipalmitoyl-phosphatidylcholine, DPPC）的納米盤制劑成功地抑制了中性粒細胞浸潤和粘附分子的表達，進而減少炎癥和致動脈粥樣硬化的過程.將磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）嵌入納米盤對動脈粥樣硬化小鼠模型進行輸注，檢測結(jié)果顯示血漿炎癥生物標記IL - 6與TNFα水平以及細胞間粘附分子水平均有降低，另一方面也反映出納米盤與PS特異性受體的相互作用可能間接有助于PS的抗炎作用. 　　圖二 循環(huán)系統(tǒng)高密度脂蛋白與納米盤代謝示意圖 圖二 循環(huán)系統(tǒng)高密度脂蛋白與納米盤代謝示意圖 　　Fig. 2 Schematic diagram of high density lipoprotein （HDL）and nanodisc metabolism in the circulatory system. 　　ApoA-1在肝臟和腸道中以無脂形式合成，與磷脂和膽固醇迅速脂化形成盤狀新生HDL.在周圍組織中，新生的HDL顆粒通過巨噬細胞ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運體吸收游離膽固醇.游離膽固醇經(jīng)卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）酯化形成膽固醇酯.成熟的HDL3粒子形成，可以轉(zhuǎn)化為HDL2，被肝臟通過SR-B1吸收.納米盤在體外裝載完畢，注射進入體內(nèi)后被重塑為球狀HDL，參與循環(huán)過程. 　　目前利用人體純化后的ApoA-1及脂質(zhì)成分結(jié)合的納米盤在這一方向的應(yīng)用進展已經(jīng)取得了一些有代表性的研究成果（見表1），Duivenvoorden等人最近開發(fā)了負載他汀類藥物的納米盤，將辛伐他汀傳遞到動脈粥樣硬化斑塊以抑制炎癥.在Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化模型體內(nèi)觀察到，由于他汀類藥物納米盤的抗炎作用，巨噬細胞的存活率降低，在一周高劑量治療后，使用gd標記顆粒的NMR觀察到炎癥顯著減少，而3個月低劑量治療通過直接靶向斑塊巨噬細胞能夠抑制斑塊炎癥.在另一個例子中，Zhang等人將血管活性心臟保護藥物丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA）納入圓盤狀納米盤中注射進入動脈粥樣硬化新西蘭兔（New Zealand white rabbit breed）模型中，進入體內(nèi)后的盤狀納米盤被酶解重塑為球形納米盤，丹參酮IIA經(jīng)納米盤承載后能更加迅速地作用于動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的泡沫細胞，表現(xiàn)出較強的抗動脈粥樣硬化作用[53].這些結(jié)果表明使用納米盤結(jié)合降脂藥物的抗增生性治療策略為動脈粥樣硬化中的炎癥打開了一個新的治療窗口. 　　表一 納米盤技術(shù)用于治療心血管疾病的代表性舉例 表一 納米盤技術(shù)用于治療心血管疾病的代表性舉例 　　動物實驗的良好結(jié)果促進研究人員進一步開展臨床試驗，目前正在進行的幾項早期試驗結(jié)果顯示患者對納米盤制劑有很好的耐受性，通過靜脈注射可顯著提高人血漿中HDL的水平，從而抑制動脈粥樣硬化壁的脂肪條紋形成和脂質(zhì)沉積，并減少動脈粥樣硬化體積和斑塊重塑的現(xiàn)象[61].對于穩(wěn)定的動脈粥樣硬化疾病患者，一次性給予適量嵌入CSL-112的納米盤制劑可顯著增加ABCA1依賴性膽固醇的代謝外排，并觀察到納米盤一旦進入循環(huán)，就會迅速重塑為成熟的球形HDL，比使用天然HDL進行輸液治療所達到的循環(huán)時間更長更具優(yōu)勢[62]. Cerenis Therapeutics公司的CER-001是另一個進入臨床試驗II期的例子，該試驗將二棕櫚?；?磷脂酰甘油(Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylglycerol）組裝進納米盤并通過靜脈注射進入血管內(nèi)，檢測結(jié)果表明雖然該制劑對膽固醇代謝外排和減輕血管炎癥有良好的作用，但灌注CER-001后并沒有觀察到冠狀動脈粥樣硬化斑塊體積的明顯消退，對急性冠脈綜合征后高斑塊負荷的狀況沒有發(fā)揮其預(yù)期的效果.在此基礎(chǔ)上值得思考的是，在進行納米盤輸注療法增加體內(nèi)HDL顆粒數(shù)量時，還必須對納米盤模擬HDL結(jié)構(gòu)和動力學進行更深刻的探討與研究[63]. 　　在培養(yǎng)的細胞和動物模型中，納米盤已經(jīng)顯示出其作為診斷和治療實體的巨大潛力，然而在臨床試驗開發(fā)的早期階段，為了滿足體外、體內(nèi)試驗的各項標準，一個主要的挑戰(zhàn)是對其物理化學特性的精確控制，制造技術(shù)、成分、濃度、輔料、鹽、pH值或溫度均會影響裝配過程中的性能變化.一旦建立了體外應(yīng)用，另一個需要關(guān)注的難點是制劑在體內(nèi)的安全治療劑量和藥物傳遞系統(tǒng)的有效性.納米盤必須符合藥物動力學的相關(guān)標準，確定獲得預(yù)期效果所需的最小治療活性劑量，以及脫靶效應(yīng)導致毒性之前的最大耐受劑量，以獲得有益的治療指標.雖然納米盤通常無毒且耐受性良好，但表面修飾或化學成分修飾可能會引發(fā)免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)，因此每一種新成分都需要進行單獨的毒理學評估.這些因素的限制導致目前只有少數(shù)試驗進行到早期臨床階段. 　　4 、結(jié)語 　　納米盤作為一種人工制備的擬膜結(jié)構(gòu)，為長期以來受結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、聚集不方便所影響的膜蛋白研究提供了更好的平臺；其大小可調(diào)，能夠適應(yīng)不同尺寸目標膜蛋白的表達需求；可提供長半衰期、強穩(wěn)定性、高可溶性和精準靶向的優(yōu)勢擬膜環(huán)境，已被廣泛應(yīng)用于膜蛋白的生產(chǎn)純化、受體配體結(jié)合的藥物靶點研究以及結(jié)構(gòu)生物學等領(lǐng)域.這種新型擬膜結(jié)構(gòu)已得到國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注與認可，已用于多種膜蛋白的深入研究，其對于脂質(zhì)體和膜蛋白出色的純化、溶解和控制作用將推動膜蛋白研究在分子化學、結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域不斷深化.同時在臨床醫(yī)學領(lǐng)域[64]，納米盤已在藥物載體、疫苗制備和多種疾病的預(yù)防與治療中展現(xiàn)出巨大的潛力.相信在不遠的將來，納米盤能夠在生物醫(yī)療領(lǐng)域為我們提供更多更加新穎、更加可靠的治療方案. 　　值得注意的是，納米盤技術(shù)相關(guān)研究仍有待突破.首先，受限于其制備材料ApoA-1衍生直徑的限制，它并不能作為跨膜片段較少膜蛋白的合適研究載體；其次，由于納米盤兩端環(huán)境的同一性，在面對需要環(huán)境差異的膜蛋白研究中有明顯的局限性，這啟發(fā)我們應(yīng)對于適用性更強的納米盤制備材料進行開發(fā).而在臨床應(yīng)用方面，納米盤的介入尚處于起步階段，應(yīng)加強對其療效特殊優(yōu)勢的研究.因此，納米盤技術(shù)仍需要進一步開發(fā)和改進. 　　參考文獻 　　[1] Wang L, Tonggu L. 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